免疫组化操作步骤

IHC 试验操作步骤

实验所需试剂：

3% H2O2 For 10.0 ml

          1.0ml   H2O2 (30%)

          9.0ml 单蒸水

TBS(1×) pH 7.6-8.0

          For 1.0 L 3.0g Tris-base 8.0g NaCl

         先加单蒸水至800ml，

          用HCL 调PH 至7.6-8.0

          加单蒸水至1.0L

TBST(1×) 0.1% Tween-20pH 7.6-8.0

For 1.0 L        1.0mlTween-20

                      1.0 LTBS (1×)

柠檬酸-柠檬酸钠修复液（1×）pH6.0 For 1.0 L 0.4g 柠檬酸· H2O

                      3.0g 柠檬酸钠 · 2H2O

                      加单蒸水至1.0 L

                      Tris-EDTA 修复液(1×) pH9.0

For 1.0 L

Tris-base        1.21g

乙二胺四乙酸二钠      0.372g

单蒸水        1.0L

实验步骤：

一. 脱蜡：

      在二甲苯（Ⅰ）中 20min，在二甲苯（Ⅱ）中 20min; 在无水乙醇（Ⅰ）中浸

泡5min; 在无水乙醇（Ⅱ）中浸泡 5min; 95%乙醇中浸泡5min; 80%乙醇中浸泡

5min; 60%乙醇中浸泡 5min; 单蒸水中 5min 泡洗三次。

二. 抗原修复：

      取一定量的Tris-EDTA 修复液于一带盖耐高温容器里，再将容器于电陶炉上煮沸，后再放入待修复切片持续沸腾15min。完毕，放在室温自然冷却，40min

后，降至室温。

备注：根据不同实验条件可选择柠檬酸修复液等不同修复液。对于某些切片必须进行修复，某些切片如果容易脱片可以省略。

三. 免疫组织化学染色：

   （1）取出切片架放入3%H2O2 溶液，于孵育盒中灭活10min，室温;

   （2）1xTBS 冲洗4-5 次，甩干，擦净，滴加3％BSA50ul-100ul，室温湿盒封闭1hour；

   （3）用吸水纸吸去多余液体（注意不要干片），滴加稀释好的一抗50 ul-

100ul，室温湿盒孵育 1.5hour 或 4℃过夜;

   （4）1xTBST 冲洗4-5 次，滴加二抗50-100ul，室温湿盒孵育30min;

   （5）1xTBS 冲洗4-5 次;滴加DAB 显色液，1－5min 后迅速冲洗干净;

   （6）滴加1 滴Mayor's 苏木精（hematoxylin），复染1-2min,TBS 溶液或自来水中水洗蓝化5-10min；

   （7）梯度酒精及二甲苯脱水：分别在60%,80%,95%,100%Ⅰ、Ⅱ酒精中浸泡 5

分钟，然后在二甲苯（III）中浸泡5 分钟，二甲苯（IV）中浸泡5 分钟。中性树

胶封片，镜检。